Príloha č. 5
k nariadeniu vlády č. .... / 2004 Z. z.

Zisťovanie cýst a lariev háďatka v pôdnych vzorkách.

I. Princíp metódy.
	Cysty háďatka sa zisťujú flotačnou metódou z dopredu pripravenej preosiatej zmesnej vzorky pôdy s hmotnosťou 200 g. Vzorka sa preplavuje slabým prúdom vody v upravenej Erlenmayerovej banke, pričom ľahké častice spolu s cystami sú vyplavované na sito s veľkosťou ôk 0,2 mm. Na site sa cysty zisťujú pomocou stereoskopickej binokulárnej lupy.

II. Pracovný postup.
	1. Suchá zmesná vzorka pôdy sa vysype do misky na úpravu vzorky, ľahko sa rozdrvia hrudky a preoseje sa sitom s veľkosťou ôk 2 mm.
	2. Z preosiatej zeminy sa odoberie vzorka s hmotnosťou 200 g, vsype sa do Erlenmayerovej banky (priemer hrdla 48 mm, obsah 2000 ml) s nástavcom z umelej hmoty a zariadením k prívodu vody a miešaniu suspenzie a naplnenej 0,3 - 0,5 l vody. Suspenzia počas plavenia predchádzajúcej vzorky sa nechá odmočiť vo vode a niekoľkokrát sa dôkladne zamieša.
	3. Obsah banky sa preplavuje 3 - 5 minút prúdom vody zavedením ku dnu banky trubicou (ø 10 mm) s tryskami k rozvíreniu suspenzie. Prúd vody je počas prvých sekúnd prudký (aby sa obsah dôkladne premiešal) a hneď ako hladina suspenzie vystúpi asi do polovice výšky banky, upraví sa na veľmi slabý (cca 750 ml.min-1). Ľahké organické častice spolu s cystami háďatka pretekajú k hornej časti banky nástavcom na sito s veľkosťou ôk 0,2 mm (vyrobené z fotografickej misky 200 x 140 mm vyrezaním dna a nalepením mlynárskeho pletiva) a väčšina ťažkých minerálnych častíc zostáva v banke. Po skončení flotácie sa slabým prúdom vody všetky častice pôdy a zvyšky detritu uchytené na nástavci banky spláchnu na sito. Po vyplavení každej vzorky sa banka s príslušenstvom dôkladne vypláchne.
	4. Sito s vyplaveným materiálom sa vloží do misky so svetlým dnom rozdeleným na pozdĺžne pásy so šírkou 10 mm a celá jeho plocha sa postupne (podľa vyznačených pruhov) prezrie pod binokulárnou lupou pri zväčšení 10 - 40-krát. Miesta so silnejšou vrstvou zachyteného materiálu sa pritom rozhŕňajú preparačnou ihlou tak, aby nedošlo k poškodeniu pletiva sita alebo k pretlačeniu tzv. mikrocýst okami sita. V prípade veľkého množstva detritu sa časť slabým prúdom vody (napr. stričkou) oddelí na ďalšie sito, a to tak, aby neprišlo ku stratám vyplaveného materiálu.
	Je možné použiť i metódu filtračnú:
	Vyplavený materiál sa pomocou stričky prenesie zo sita do nálievky (ø 12 cm) vyloženej kruhovým filtračným papierom. Voda pritom odteká do podloženej vhodnej nádoby a cysty háďatka sa usádzajú hlavne na vonkajšom okraji filtračného papiera, kde sa zisťujú binokulárnou lupou.
	5. Nájdené cysty háďatok sa vyberajú pomocou navlhčenej preparačnej ihly alebo pinzetou. Ak sa ich determinácia nerobí hneď, presypú sa k dočasnému uschovaniu (v suchom stave) do skúmaviek alebo fľaštičiek.
	Pri vysokom počte cýst sa obsah misky alebo filtračného papiera po obschnutí presype na plechový regulovač podľa Behringera, na ktorom sa opakovaným preguľovaním pri klepaní na dno a miernom naklopení oddelia cysty od detritu a netreba ich jednotlivo preberať.
	6. Prezretý obsah a zbytok zeminy sa v plechovom vedre asanuje (príloha č. 10). Potom sa dôkladne rozriedi vodou a vyleje do kanalizácie alebo na iné určené miesto.
	Pre plavenie pôdnych vzoriek je možné využiť i prístroj MEKU-Bodenprobenextraktor (firma Anseln, Rakúsko). Pracovný postup sa riadi metodikou uvedenou výrobcom.
Po zistení prítomnosti háďatka zemiakového vo vzorke nasleduje determinácia Globodera rostochiensis alebo Globodera pallida morfometricky pomocou kľúča alebo DAS ELISA sérologickou metódou.

III. Determinácia cýst háďatka a určenie ich životnosti.
A. Morfometricky pomocou kľúča.
	Kľúč háďatok rodu Globodera.
1. a) Cysta citrónovitého tvaru t.j. s vulvou na výraznom výčnelku ...................... 2.
    b) Cysta vajcovitá až guľovitá t.j. so zadnou časťou zaoblenou, vulva nie je umiestnená na výraznom výčnelku ....................................................................................... 3.
2. Heterodera spp.
3. Globodera spp., Punctodera spp.
    a) Cysta väčšinou hruškovitá až vajcovitá, matná, anus približne veľký ako vulva, dve okienka, hyalinná časť chvosta larvy výrazne (cca 1,5-krát) dlhšia ako stylet;
         hostiteľské rastliny: pšenica, kukurica a iné trávy
						......................... Punctodera punctata;
    b) Cysta vajcovitá až guľovitá, väčšinou lesklá, anus oveľa menší ako vulva, 1 okienko, hyalinná časť chvosta larvy približne rovnako dlhá ako stylet ..................... 4.
4. a) Vzdialenosť vulva-anus v priemere viac ako 2-krát väčšia ako priemer vulvárneho okienka ......................................................................................................... 5.
    b) Vzdialenosť vulva-anus v priemere menej ako 2-krát väčšia ako priemer vulvárneho okienka ......................................................................................................... 6.
5. a) Vzdialenosť vulva-anus v priemere 4,6 (2,7-8,9)-krát väčšia ako priemer okienka; medzi anusom a okienkom v priemere 21 (16 - 31) zvrásnených línií kutikuly; samičky biele so žltou fázou vývoja k hnedým cystám; rozšírená bazálna časť styletu lariev zaoblená, ľahko zahnutá dozadu (smerom k chvostu larvy);
hostiteľské rastliny: zemiaky, rajčiak, ľuľok baklažánový, ľuľok čierny a iné druhy čeľade ľuľkovité			............................. Globodera rostochiensis;
     b) Vzdialenosť vulva-anus 2,1-2,5-krát väčšia ako priemer okienka; medzi anusom a okienkom v priemere 12 (8 - 20) zvrásnených línií kutikuly; samičky biele až krémové bez žltej fázy vývoja k hnedým cystám; rozšírená bazálna časť styletu lariev zaostrená a ľahko zahnutá dopredu;
         hostiteľské rastliny: ako pri druhu Globodera rostochiensis
						.............................. Globodera pallida;
6. a) Koniec chvosta lariev slabo zaoblený; vzdialenosť vulva - anus v priemere 1,5 (0,9-2,8)-krát väčšia ako priemer okienka, medzi vulvou a anusom v priemere menej ako 14 zvrásnených línií kutikuly; samičky biele so žltou fázou vývoja k hnedým cystám; rozšírená báza styletu lariev – ako pri druhu Globodera rostochiensis;
         hostiteľské rastliny: tabak, rajčiak, paprika, ľuľok baklažánový, nie zemiaky
					............................. Globodera tabacum;
     b) Koniec chvosta lariev zaostrený; samičky mliečno-krémovej farby, matné, bez žltej fázy vývoja k hnedým cystám; 
- vzdialenosť vulva-anus v priemere 1,0 (0,8-1,7)-krát väčšia ako priemer okienka; medzi anusom a okienkom v priemere 7 - 8 zvrásnených línií kutikuly; rozšírená bazálna časť styletu lariev – ako pri druhu Globodera rostochiensis;
         hostiteľská rastlina: Artemisia rubripes (palina)
						.............................. Globodera artemisiae;
- vzdialenosť vulva-anus 1,8 - 2,2-krát väčšia ako priemer okienka; medzi anusom a okienkom v priemere 8 vrások kutikuly;
hostiteľské rastliny: väčší počet druhov čeľade astrovité vrátane niektorých bežných burín
						............................... Globodera millefolii.

Poznámky:
1)	V kľúči nie sú uvedené druhy Globodera leptonepia (parazit zemiakov v Peru), Globodera mali (parazit jablone v Kazachstane) a niektoré ďalšie druhy, ktorých výskyt je vzácny a u nás nepravdepodobný.
2)	K úplne bezpečnému odlíšeniu cýst háďatka zemiakového získaných z pôdy od iných druhov Globodera je spravidla potrebný väčší počet cýst (aspoň 10).
3)	Pri rozbore pôdnych vzoriek je z uvedených druhov najpravdepodobnejšie zistenie Globodera rostochiensis a Punctodera punctata.

Mikroskopické vyšetrenie povrchu cýst.
	Cysta sa vloží (najlepšie po 24-hodinovom predmáčaní) do kvapky vody na podložnom sklíčku a preparačnou ihlou alebo skalpelom sa pod binokulárnou lupou odreže jej zadná tretina. Z odrezanej tretiny cysty sa preparačnou ihlou odstráni vnútorný obsah. Zostávajúci obsah sa prenesie do ďalšej kvapky vody (alebo laktofenolu) na podložnom sklíčku tak, aby vonkajšia časť kutikuly (vypuklá strana) bola obrátená k pozorovateľovi. Prikryje sa krycím sklíčkom a prezerá pod mikroskopom pri zväčšení aspoň 75-krát. Sleduje sa veľkosť okienka (t.j. priesvitného areálu okolo vulvy) a anusu (pri háďatku zemiakovom malý tmavší bod, od ktorého vybiehajú smerom od vulvy dve línie v podobe písmena V), ich vzdialenosť a počet zvrásnených línií kutikuly medzi nimi.

GLOBODERA ROSTOCHIENSIS
GLOBODERA PALLIDA

A, B – Globodera pallida – Stylet 2. larválneho štádia. C, D – G. rostochiensis – Stylet 2.
larválneho štádia. E – G. pallida – Análno-vulválna čať cysty. F – G. rostochiensis – Análno-
vulválna čať cysty.
3

anus

vulva

okienka

zvrásnenie

B

A

C

A – Glodobera rostochiensis – Análno-vulválna čať cysty. B – G. pallida – Análno-vulválna čať cysty. (Foto: A. R. Stone). C – G. rostochiensis – Samičky a cysty vyčnievajúce z koreňov zemiakov. (Foto: C. C. Doncaster).

Mikroskopické vyšetrenie a určenie životnosti obsahu cysty.
a) vo vode
	Cysta sa vloží do kvapky na podložnom sklíčku a vnútorný obsah sa z nej vypreparuje pomocou preparačnej ihly (súčasne s vyšetrovaním povrchu cysty) alebo sa z nej vytlačí miernym tlakom na krycie sklíčko.
	Ak je k dispozícii viac cýst, je možné ich pod krycím sklíčkom roztlačiť naraz niekoľko. Väčší počet cýst (aspoň 10) je možné tiež jemne rozdrviť asi v 0,5 ml vody v malej silnostennej skúmavke pomocou sklenenej tyčinky alebo v ručnom homogenizátore na 5 cm. Zo vzniknutej suspenzie sa pipetou odoberie kvapka k mikroskopickému vyšetreniu.
	U lariev háďatka sa sledujú znaky uvedené v determinačnom kľúči. Živé larvy majú červovitý tvar tela, nenarušenú štruktúru vnútorných orgánov, v prednej časti tela a na konci chvosta telový obsah hyalinný, v strednej časti tela zrnitý; niekedy je možné pozorovať i pomalý pohyb lariev. Telový obsah mŕtvych lariev je zrnitý po celej dĺžke tela, býva silne vakualizovaný a tvar tela je často zalomený.
	V živých embryonoch sú viditeľné kontúry esovite stočenej larvy a hyalinná predná časť jej tela; ostatný obsah je rovnomerne zrnitý. Mŕtve embryony majú vnútorný obsah dezintegrovaný, lebo sú zle vyvinuté alebo deformované. Súčasťou obsahu cysty sú i prázdne vaječné obaly po vyliahnutých larvách.

b) v koreňovom difuzáte
	Zistenie životnosti cýst a určenie podľa lariev je možné uľahčiť uložením cýst pred mikroskopickým vyšetrením na 6 - 8 dní do malého množstva (cca 0,5 ml) koreňového difuzátu zemiakov. Pri väčšom počte cýst je možné dobu pôsobenia difuzátu predĺžiť až na 12 i viac dní a drvenie cýst urobiť priamo v difuzáte. Zvýši sa tak počet lariev, ktoré sa vyliahnu z vaječných obalov a pohybujú sa , čím je určenie životnosti veľmi uľahčené.
	Príprava koreňového difuzátu: zdravé, najlepšie naklíčené hľuzy zemiakov sa uložia do vlhkého piesku na zakorenenie. 5 - 10 vzídených výhonkov so zdravými hustými koreňmi sa opláchne vodou a korene výhonkov sa ponoria do vysokej kadičky (150 ml) s destilovanou vodou na 24 hodín. Získaný roztok koreňového difuzátu sa prefiltruje a uloží v tmavej fľaštičke (napr. liekovke na 100 ml) pri teplote 4 - 12C. Je použiteľný počas niekoľkých mesiacov.
	Nepoužité cysty háďatka zemiakového sa uskladnia ako dokladový materiál v suchom stave vo fľaštičkách po dobu jedného roka.

B. DAS ELISA sérologická metóda
Ku každej diagnostickej ELISA súprave je priložená metodika testovania, podľa ktorej sa postupuje.

Metodika testovania podľa metodiky priloženej ku diagnostickej ELISA súprave Loewe Biochemica GmbH, Nemecko.
Príprava vzorky
Z celej vzorky sa vyberie iba jedna plná cysta, ktorá sa dôkladne zhomogenizuje v 5 µl homogenizačného pufru (10 mM TRIS/HCl, pH 7,4) v 1,5 ml Ependorfovej skúmavke. Pod binokulárnym mikroskopom sa skontroluje, či sú vajíčka dôkladne zhomogenizované.
Pridá sa 150 µl homogenizačného pufru a ďalšími 160 µl homogenizačného pufru sa kvantitatívne zmyjú zvyšky cysty z homogenizátora.
Vzorky sa vložia do vodného kúpeľa na 10 minút pri 100ºC.
Centrifuguje sa pri 13 000 rpm 10 minút a po centrifugácii sa resuspenduje.
Príprava platne:
Riadky A, B, E a F sa naplnia 100 µl kótovacieho pufru. Do jamiek B3 a E3 sa napipetuje po 100 µl nariedeného štandardného antigénu Globodera pallida. Do jamiek B3 a F3 sa napipetuje 100 µl nariedeného štandardného antigénu Globodera rostochiensis. Postupne sa riedia (kalibračné krivky) oba štandardné antigény týmto spôsobom:
Z jamky A3 sa prenesie 100 µl do jamky A4, premieša sa, z A4 sa prenesie 100 µl do A5, premieša sa atď.
Do riadkov C, D a G, H sa pridá 100 µl nariedenej vzorky s kótovacím pufrom v pomere 1:1 a 1:9.
Takto pripravené platne sa prikryjú a inkubujú pri izbovej teplote cez noc.
Premývanie:
Platne sa premývajú 5x s PBS pufrom.

Postkótovanie:
Do každej jamky sa pridá 200 µl postkótovacieho pufru a prikryté platne sa inkubujú 30 minút pri izbovej teplote.
Premývanie:
Platne sa premývajú 5x s PBS pufrom.
Reakcia antigén / protilátka:
Do riadkov A, B, C a D sa pridá 100 µl nariedenej protilátky MAB 1 rp a do riadkov E, F, G a H sa pridá 100 µl nariedenej protilátky MAB 2r. Prikryté platne sa inkubujú 1 hodinu pri 37ºC.
Premývanie:
Platne sa premývajú 5x s PBS pufrom.
Označenie protilátky AP – konjugátom:
Do každej jamky sa pridá 100 µl protilátky AP – konjugát a prikryté platne sa inkubujú 1 hodinu pri 37ºC.
Premývanie:
Platne sa premývajú 5x s PBS pufrom.
Enzýmová skúška:
Do každej jamky sa pridá 100 µl substrátového roztoku. Odokryté platne sa inkubujú 1 až 2 hod pri 37ºC. Intenzita zafarbenia sa meria pri vlnovej dĺžke 405 nm.

IV. Určenie intenzity zamorenia pôdy (doporučená metodika).
	Stupeň zamorenia pôdy sa vyjadruje počtom lariev na 1 g zeminy. Stanovuje sa z 30 až 50 náhodne vybraných cýst, pri menšom počte zo všetkých zistených cýst.
	Cysty sa uložia do malej hrubostennej skúmavky alebo ručného homogenizátora s cca 0,5 ml koreňového difuzátu zemiakov. Po 8 - 15 dňoch sa jemne ale dôkladne rozdrvia sklenenou tyčinkou a doplní sa voda (pri súčasnom opláchnutí tyčinky) na celkový objem 1 - 2 ml (podľa hustoty suspenzie z rozdrvených cýst). Niekoľkonásobným nasatím a vypustením späť sa suspenzia pomocou pipety dôkladne premieša a odoberie sa kvapka na podložné mikroskopické sklíčko. Pod celou plochou krycieho sklíčka sa potom pri zväčšení cca 75-krát počítajú živé larvy a embryony. Pri prezeraní plochy pod krycím sklíčkom sa postupuje podľa prílohy č. 4 bod II. 17. Zo suspenzie sa odoberie a prezrie spolu 5 kvapiek a z nich sa vypočíta priemerný počet živých lariev a embryonov v jednej kvapke. Počet živých lariev a embryonov v 1 g zeminy (N) sa vypočíta podľa vzorca:
					N =  , kde
	m - priemerný počet živých lariev a embryonov v jednej kvapke,
	n - dopredu zistený počet kvapiek pre danú pipetu z 1 ml suspenzie,
	k - celkový objem suspenzie v ml,
	y - počet cýst na 200 g zeminy,
	x - počet šetrených (rozdrvených) cýst.
Intenzita zamorenia pôdy v počte živých lariev a embryonov v 1 g sa hodnotí nasledovne:
	slabá .......... do 10,
	stredná .......11 - 50,
	silná ............viac ako 50.

V. Upozornenie.
	Podmienkou vykonávania analýz vzoriek pôdy na prítomnosť cýst háďatka, ich určenie i stanovenie stupňa zamorenia pôdy je dôkladné a praktické zaškolenie zodpovedného pracovníka.